赵飞燕, 赵艺, 王帅奇, 任宪锋, 冀照君, 李国瑞
【目的】明确YgfZ基因在根瘤菌与豆科植物共生固氮体系中的调控生长作用,建立YgfZ蛋白的表达纯化体系,为探索根瘤菌结瘤固氮分子机制奠定基础。【方法】以根瘤菌R. yanglingense CCBAU 01603为材料,通过DNA体外扩增和核酸电泳检测克隆YgfZ基因;通过生物信息学分析,利用Expasy-ProtParam分析YgfZ蛋白的理化性质,并进行蛋白诱导表达及蛋白可溶性表达的检测与纯化。【结果】YgfZ基因片段长度为840 bp,具有完整的开放阅读框,编码279个氨基酸,分子质量为29.36 ku,理论等电点(pI)为5.40。通过PCR扩增YgfZ基因,将其连接至载体pETM30,成功构建重组质粒YgfZ,将其转化至大肠杆菌。经不同浓度、温度和时间诱导条件下的优化试验,确定最佳诱导体系为IPTG 0.1 mmol/L、18 ℃下诱导20 h,可获得最高水平的目的蛋白表达。通过优化缓冲体系条件,采用20 mmol/L Tris-Hcl、500 mmol/L NaCl缓冲液的不同咪唑比例洗脱的亲和层析试验、无盐缓冲液与高盐缓冲液的阴离子交换层析试验和低盐缓冲液凝胶过滤层析试验,可最终获得高纯度且性质均一的可溶性YgfZ蛋白。YgfZ蛋白在缓冲液中保持溶解状态,且不易聚集,SDS-PAGE电泳显示单一条带,无降解片段。【结论】通过设计引物成功克隆YgfZ基因,连接pETM30原核表达载体,具备高效运作和成本低廉的双重优势;通过优化诱导体系,可实现目标蛋白的高效表达;通过镍柱结合、亲和吸附、蛋白浓缩粗分离和精细纯化等步骤,可获得高纯度可溶YgfZ蛋白,为解析蛋白功能及探索根瘤菌固氮作用的分子机制提供参考。